Ugonjwa wa Alzeima (AD) hauna viashirio vya kibayolojia vya protini ambavyo huakisi patholojia yake nyingi ya msingi, hivyo kuzuia maendeleo ya utambuzi na matibabu. Hapa, tunatumia proteomics za kina kutambua viambulishi vya ugiligili wa ubongo (CSF) ambavyo vinawakilisha anuwai ya patholojia ya AD. Multiplex mass spectrometry ilibainisha takriban 3,500 na takriban protini 12,000 katika AD CSF na ubongo, mtawalia. Uchanganuzi wa mtandao wa proteome ya ubongo ulisuluhisha moduli 44 za bayoanuwai, 15 kati yake zilipishana na proteome ya ugiligili wa ubongo. Alama za AD za CSF katika moduli hizi zinazopishana zimekunjwa katika vikundi vitano vya protini, vinavyowakilisha michakato tofauti ya patholojia. Sinapsi na metabolites katika ubongo wa AD hupungua, lakini CSF huongezeka, wakati myelination yenye utajiri wa glial na vikundi vya kinga katika ubongo na CSF huongezeka. Uthabiti na umaalumu wa ugonjwa wa mabadiliko ya jopo ulithibitishwa katika zaidi ya sampuli 500 za ziada za CSF. Vikundi hivi pia vilitambua vikundi vidogo vya kibayolojia katika Alzeima isiyo na dalili. Kwa ujumla, matokeo haya ni hatua ya kuahidi kuelekea zana za alama za kibayolojia za wavuti kwa matumizi ya kimatibabu katika Alzeima.
Ugonjwa wa Alzeima (AD) ndio kisababishi cha kawaida cha shida ya akili ya ugonjwa wa neva duniani kote na una sifa ya aina mbalimbali za matatizo ya mfumo wa kibaolojia, ikiwa ni pamoja na maambukizi ya sinepsi, kinga ya glial-mediated, na kimetaboliki ya mitochondrial (1-3). Walakini, viashirio vyake vilivyoanzishwa vya protini bado vinazingatia kugundua protini ya amiloidi na tau, na kwa hivyo haziwezi kuakisi ugonjwa huu tofauti. Alama hizi za "msingi" za protini ambazo hupimwa kwa uhakika zaidi katika ugiligili wa ubongo (CSF) ni pamoja na (i) amiloidi beta peptidi 1-42 (Aβ1-42), ambayo huakisi uundaji wa plaki za amiloidi gamba; (ii) tau jumla, ishara ya kuzorota kwa axon; (iii) phospho-tau (p-tau), mwakilishi wa pathological tau hyperphosphorylation (4-7). Ingawa alama hizi za bioalama za ugiligili wa ubongo zimewezesha sana ugunduzi wetu wa magonjwa ya protini ya AD "yaliyo alama" (4-7), zinawakilisha sehemu ndogo tu ya biolojia changamano nyuma ya ugonjwa huo.
Ukosefu wa uanuwai wa kiafya wa viashirio vya Alzeima umesababisha changamoto nyingi, zikiwemo (i) kutokuwa na uwezo wa kutambua na kutathmini tofauti za kibayolojia za wagonjwa wa Alzeima, (ii) kipimo cha kutosha cha ukali na maendeleo ya ugonjwa, hasa katika hatua ya awali ya kliniki, Na ( iii) maendeleo ya madawa ya matibabu ambayo yameshindwa kutatua kabisa vipengele vyote vya kuzorota kwa neva. Kuegemea kwetu kwa ugonjwa wa kihistoria kuelezea AD kutokana na magonjwa yanayohusiana huongeza tu matatizo haya. Ushahidi zaidi na zaidi unaonyesha kuwa wazee wengi walio na shida ya akili wana tabia zaidi ya moja ya kupungua kwa utambuzi (8). Takriban 90% au zaidi ya watu walio na ugonjwa wa AD pia wana ugonjwa wa mishipa, inclusions za TDP-43, au magonjwa mengine ya kuzorota (9). Viwango hivi vya juu vya mwingiliano wa kiafya vimevuruga mfumo wetu wa sasa wa utambuzi wa shida ya akili, na ufafanuzi wa kina zaidi wa ugonjwa wa ugonjwa unahitajika.
Kwa kuzingatia hitaji la dharura la alamisho mbalimbali za AD, uwanja huo unazidi kutumia mbinu ya "omics" kulingana na mfumo wa jumla wa kugundua alama za viumbe. Muungano wa Accelerated Pharmaceutical Partnership (AMP)-AD ulizinduliwa mwaka wa 2014 na uko mstari wa mbele katika mpango huo. Juhudi hizi za fani mbalimbali na Taasisi za Kitaifa za Afya, wasomi, na tasnia inalenga kutumia mikakati ya msingi ya mfumo kufafanua vyema pathophysiolojia ya AD na kuendeleza uchambuzi wa uchunguzi wa bioanuwai na mikakati ya matibabu ( 10 ). Kama sehemu ya mradi huu, proteomics za mtandao zimekuwa zana ya kuahidi kwa maendeleo ya alama za kibayolojia za mfumo katika AD. Hii unbiased data inayotokana mbinu kupanga data proteomics tata seti katika makundi au "modules" ya protini ushirikiano walionyesha kwamba ni kuhusishwa na aina maalum ya seli, organelles, na kazi za kibiolojia (11-13). Takriban tafiti 12 za proteomics za mtandao zilizo na habari nyingi zimefanywa kwenye ubongo wa AD (13-23). Kwa ujumla, uchanganuzi huu unaonyesha kuwa proteome ya mtandao wa ubongo wa AD hudumisha shirika la kawaida lililohifadhiwa katika vikundi huru na maeneo mengi ya gamba. Kwa kuongeza, baadhi ya moduli hizi zinaonyesha mabadiliko yanayoweza kuzaliana katika wingi unaohusiana na AD katika seti za data, zinazoonyesha ugonjwa wa magonjwa mbalimbali. Kwa pamoja, matokeo haya yanaonyesha msingi wa kuahidi wa ugunduzi wa mtandao wa ubongo wa proteome kama alama ya kibayolojia inayotokana na mfumo katika AD.
Ili kubadilisha proteome ya mtandao wa ubongo wa AD kuwa vialamisho muhimu vya kiafya vinavyotokana na mfumo, tuliunganisha mtandao unaotokana na ubongo na uchanganuzi wa proteomic wa AD CSF. Mbinu hii iliyounganishwa ilisababisha kutambuliwa kwa seti tano za kuahidi za alama za viumbe za CSF ambazo zinahusishwa na aina mbalimbali za patholojia zinazotegemea ubongo, ikiwa ni pamoja na sinepsi, mishipa ya damu, miyelini, kuvimba, na kutofanya kazi kwa njia za kimetaboliki. Tuliidhinisha vidirisha hivi vya alama za kibayolojia kupitia uchanganuzi mwingi wa urudufishaji, ikijumuisha zaidi ya sampuli 500 za CSF kutoka magonjwa mbalimbali ya mfumo wa neva. Uchanganuzi huu wa uthibitishaji unajumuisha kuchunguza malengo ya kikundi katika CSF ya wagonjwa wenye AD isiyo na dalili (AsymAD) au kuonyesha ushahidi wa mkusanyiko usio wa kawaida wa amiloidi katika mazingira ya kawaida ya utambuzi. Uchanganuzi huu unaangazia tofauti kubwa ya kibayolojia katika idadi ya watu wa AsymAD na kutambua viashirio vya paneli ambavyo vinaweza kuwafanya watu binafsi katika hatua za mwanzo za ugonjwa. Kwa ujumla, matokeo haya yanawakilisha hatua muhimu katika uundaji wa zana za alama za kibayolojia za protini kulingana na mifumo mingi ambayo inaweza kusuluhisha kwa mafanikio changamoto nyingi za kiafya zinazokabili AD.
Kusudi kuu la utafiti huu ni kubaini viashirio vipya vya ugiligili wa ubongo ambavyo vinaakisi pathofiziolojia ya msingi wa ubongo ambayo husababisha Alzeima. Kielelezo S1 kinaelezea mbinu yetu ya utafiti, ambayo ni pamoja na (i) uchanganuzi wa kina unaoendeshwa na matokeo ya awali ya AD CSF na mtandao wa proteome ya ubongo ili kutambua viashirio vingi vinavyohusiana na ubongo vya ugonjwa wa CSF, na (ii) urudufishaji unaofuata Alama hizi za kibayolojia ziko kwenye ubongo kadhaa huru. makundi ya maji. Utafiti unaolenga ugunduzi ulianza na uchanganuzi wa usemi tofauti wa CSF katika watu 20 wa kawaida kiakili na wagonjwa 20 wa AD katika Kituo cha Utafiti wa Magonjwa ya Alzeima (ADRC) cha Emory Goizueta. Utambuzi wa Alzeima hufafanuliwa kuwa ulemavu mkubwa wa kiakili katika uwepo wa Aβ1-42 ya chini na viwango vya juu vya tau na p-tau jumla katika ugiligili wa ubongo [Mean Montreal Cognitive Assessment (MoCA), 13.8 ± 7.0] [ELISA (ELISA) )]] (Jedwali S1A). Udhibiti (wastani wa MoCA, 26.7 ± 2.2) ulikuwa na viwango vya kawaida vya viashirio vya viumbe vya CSF.
CSF ya binadamu ina sifa ya msururu wa wingi wa protini, ambapo albumin na protini nyingine nyingi sana zinaweza kuzuia ugunduzi wa protini zinazovutia (24). Ili kuongeza kina cha ugunduzi wa protini, tuliondoa protini 14 za kwanza kwa wingi kutoka kwa kila sampuli ya CSF kabla ya uchanganuzi wa molekuli spectrometry (MS) (24). Jumla ya peptidi 39,805 zilitambuliwa na MS, ambazo zilichorwa kwa protini 3691 katika sampuli 40. Ukadiriaji wa protini unafanywa na lebo nyingi za sanjari (TMT) (18, 25). Ili kutatua data iliyokosekana, tulijumuisha protini zile pekee ambazo zilihesabiwa katika angalau 50% ya sampuli katika uchanganuzi uliofuata, na hivyo hatimaye kuhesabu proteni 2875. Kutokana na tofauti kubwa katika viwango vya wingi wa protini, sampuli ya udhibiti ilizingatiwa kitakwimu kuwa ya nje (13) na haikujumuishwa katika uchanganuzi uliofuata. Thamani za wingi wa sampuli 39 zilizosalia zilirekebishwa kulingana na umri, jinsia, na ushirikiano wa kundi (13-15, 17, 18, 20, 26).
Kwa kutumia uchanganuzi wa t-takwimu ili kutathmini usemi tofauti kwenye seti ya data ya urejeshaji, uchanganuzi huu ulitambua protini ambazo viwango vyake vya wingi vilibadilishwa kwa kiasi kikubwa (P <0.05) kati ya udhibiti na visa vya AD (Jedwali S2A). Kama inavyoonyeshwa kwenye Mchoro 1A, wingi wa jumla ya protini 225 katika Alzeima ulipungua kwa kiasi kikubwa, na wingi wa protini 303 uliongezeka kwa kiasi kikubwa. Protini hizi zilizoonyeshwa kwa njia tofauti ni pamoja na viashirio kadhaa vya AD vya ugiligili wa ubongo vilivyotambuliwa hapo awali, kama vile protini tau inayohusishwa na mikrotubule (MAPT; P = 3.52 × 10−8), neurofilamenti (NEFL; P = 6.56 × 10−3), Protini inayohusiana na ukuaji 43. (GAP43; P = 1.46 × 10−5), Asidi ya Mafuta Kufunga Protini 3 (FABP3; P = 2.00 × 10−5), Chitinase 3 kama 1 (CHI3L1; P = 4.44 × 10−6), Granulin ya Neural (NRGN; P = 3.43 × 10-4) na sababu ya ukuaji wa ujasiri wa VGF (VGF; P = 4.83 × 10-3) (4-6). Hata hivyo, tulitambua pia malengo mengine muhimu sana, kama vile kizuizi cha 1 cha kutenganisha Pato la Taifa (GDI1; P = 1.54 × 10-10) na kifungaji cha 1 cha kalsiamu kinachohusiana na SPARC (SMOC1; P = 6.93 × 10-9) . Uchanganuzi wa Ontolojia ya Jeni (GO) wa protini 225 zilizopunguzwa sana ulifunua uhusiano wa karibu na michakato ya ugiligili wa mwili kama vile kimetaboliki ya steroidi, mgando wa damu, na shughuli za homoni (Mchoro 1B na Jedwali S2B). Kinyume chake, protini iliyoongezeka kwa kiasi kikubwa ya 303 inahusiana kwa karibu na muundo wa seli na kimetaboliki ya nishati.
(A) Mpangilio wa eneo la volcano unaonyesha mabadiliko ya mkunjo wa log2 (x-axis) yanayohusiana na thamani ya P ya takwimu -log10 (y-axis) iliyopatikana kwa jaribio la t, ambayo hutumiwa kugundua usemi tofauti kati ya udhibiti (CT) na. Kesi za AD za protini ya CSF Ya protini zote. Protini zilizo na viwango vilivyopunguzwa sana (P <0.05) katika Alzeima huonyeshwa kwa rangi ya samawati, huku protini zilizo na viwango vya juu vya ugonjwa huonyeshwa kwa rangi nyekundu. Protini iliyochaguliwa imewekwa alama. (B) Maneno ya juu ya GO yanayohusiana na protini yamepunguzwa sana (bluu) na kuongezeka (nyekundu) katika Alzeima. Inaonyesha masharti matatu ya GO yenye alama z za juu zaidi katika nyanja za michakato ya kibiolojia, utendaji wa molekuli na vijenzi vya seli. (C) MS ilipima kiwango cha MAPT katika sampuli ya CSF (kushoto) na uunganisho wake na sampuli ya kiwango cha tau cha ELISA (kulia). Mgawo wa uunganisho wa Pearson na thamani P husika huonyeshwa. Kwa sababu ya ukosefu wa data ya ELISA kwa kesi moja ya AD, takwimu hizi ni pamoja na maadili ya kesi 38 kati ya 39 zilizochanganuliwa. (D) Uchanganuzi wa nguzo unaosimamiwa (P <0.0001, Benjamini-Hochberg (BH) iliyorekebishwa P <0.01) kwenye udhibiti na AD CSF ilipata sampuli zinazotumia protini 65 zilizobadilishwa kwa kiasi kikubwa zaidi katika seti ya data. Sawazisha, rekebisha.
Kiwango cha proteomic cha MAPT kinahusiana kwa karibu na kiwango cha tau cha ELISA kilichopimwa kwa kujitegemea (r = 0.78, P = 7.8 × 10-9; Kielelezo 1C), kusaidia uhalali wa kipimo chetu cha MS. Baada ya usagaji wa trypsin katika kiwango cha protini ya amiloidi tangulizi (APP), peptidi mahususi za isoform zilizowekwa kwenye C-terminus ya Aβ1-40 na Aβ1-42 haziwezi kuainishwa kwa ufanisi (27, 28). Kwa hivyo, peptidi za APP tulizotambua hazina uhusiano wowote na viwango vya ELISA Aβ1-42. Ili kutathmini usemi tofauti wa kila kisa, tulitumia protini zilizoonyeshwa kwa njia tofauti na P <0.0001 [kiwango cha ugunduzi wa uwongo (FDR) kilichosahihishwa P <0.01] kufanya uchanganuzi wa nguzo unaosimamiwa wa sampuli (Jedwali S2A). Kama inavyoonyeshwa katika Mchoro 1D, protini hizi 65 muhimu sana zinaweza kuunganisha kwa usahihi sampuli kulingana na hali ya ugonjwa, isipokuwa kwa kesi moja ya AD yenye sifa kama za udhibiti. Kati ya protini hizi 65, 63 ziliongezeka katika AD, wakati mbili tu (CD74 na ISLR) zilipungua. Kwa jumla, uchanganuzi huu wa ugiligili wa ubongo umetambua mamia ya protini katika Alzeima ambayo inaweza kutumika kama viashirio vya ugonjwa.
Kisha tulifanya uchambuzi huru wa mtandao wa proteome ya ubongo ya AD. Kikundi cha ubongo cha uvumbuzi huu kilijumuisha dorsolateral prefrontal cortex (DLPFC) kutoka kwa udhibiti (n = 10), ugonjwa wa Parkinson (PD; n = 10), matukio ya AD/PD (n = 10) na AD (n = 10) mchanganyiko. ) Mfano. Emery Goizueta ADRC. Idadi ya watu ya kesi hizi 40 imeelezwa hapo awali (25) na imefupishwa katika Jedwali S1B. Tulitumia TMT-MS kuchanganua tishu hizi 40 za ubongo na kundi la replication la visa 27. Kwa jumla, seti hizi mbili za data za ubongo zilitoa peptidi 227,121 za kipekee, ambazo zilipangwa kwa proteomes 12,943 (25). Ni protini tu ambazo zilihesabiwa katika angalau 50% ya kesi zilijumuishwa katika uchunguzi uliofuata. Seti ya mwisho ya data ya ugunduzi ina protini 8817 zilizopimwa. Rekebisha viwango vya wingi wa protini kulingana na umri, jinsia, na muda wa baada ya kifo (PMI). Uchanganuzi wa usemi tofauti wa data iliyowekwa baada ya kurekebishwa ulionyesha kuwa > viwango vya protini 2000 vilibadilishwa kwa kiasi kikubwa [P <0.05, uchanganuzi wa tofauti (ANOVA)] katika vikundi viwili au zaidi vya magonjwa. Kisha, tulifanya uchanganuzi wa nguzo unaosimamiwa kulingana na protini zilizoonyeshwa kwa njia tofauti, na P <0.0001 katika AD/control na/au AD/PD kulinganisha (Mchoro S2, A na B, Jedwali S2C). Protini hizi 165 zilizobadilishwa sana zinaonyesha wazi kesi zilizo na ugonjwa wa AD kutoka kwa udhibiti na sampuli za PD, kuthibitisha mabadiliko makubwa ya AD-mahususi katika proteome nzima.
Kisha tukatumia algoriti iitwayo Weighted Gene Co-expression Network Analysis (WGCNA) kufanya uchanganuzi wa mtandao kwenye proteome ya ubongo iliyogunduliwa, ambayo hupanga data iliyowekwa katika moduli za protini na mifumo ya kujieleza sawa (11-13). Uchanganuzi ulibainisha moduli 44 (M) zilizoonyeshwa pamoja, zilizopangwa na kuhesabiwa kutoka kwa kubwa (M1, n = 1821 protini) hadi ndogo (M44, n = 34 protini) (Mchoro 2A na Jedwali S2D) ). Kama ilivyotajwa hapo juu. Kwa ujumla, moduli 17 zilihusiana sana na neuropathology ya AD (P <0.05). Nyingi za moduli hizi zinazohusiana na ugonjwa pia zina alama nyingi za aina ya seli (Mchoro 2B). Kama ilivyoelezwa hapo juu (13), uboreshaji wa aina ya seli hubainishwa kwa kuchanganua mwingiliano wa moduli na orodha ya marejeleo ya jeni mahususi za aina ya seli. Jeni hizi zinatokana na data iliyochapishwa katika niuroni za panya zilizotengwa, seli za mwisho na za glial. Jaribio la mpangilio wa RNA (RNA-seq) (29).
(A) Gundua WGCNA ya proteome ya ubongo. (B) Uchanganuzi wa uwiano wa kati wa uzani wa uzani (BiCor) wa protini ya saini ya msimu (sehemu kuu ya kwanza ya usemi wa kawaida wa protini) yenye sifa za neuropatholojia ya AD (juu), ikijumuisha alama za CERAD (Aβ) na alama za Braak (tau tangles). Ukali wa uwiano chanya (nyekundu) na hasi (bluu) unaonyeshwa na ramani ya joto ya rangi mbili, na nyota zinaonyesha umuhimu wa takwimu (P <0.05). Tumia Jaribio Halisi la Hypergeometric Fisher (FET) (chini) kutathmini uhusiano wa aina ya seli ya kila moduli ya protini. Ukali wa kivuli nyekundu huonyesha kiwango cha uboreshaji wa aina ya seli, na nyota inaonyesha umuhimu wa takwimu (P <0.05). Tumia njia ya BH kusahihisha thamani ya P inayotokana na FET. (C) Uchambuzi wa GO wa protini za msimu. Michakato ya kibaolojia inayohusiana kwa karibu zaidi inaonyeshwa kwa kila moduli au kikundi cha moduli inayohusiana. oligo, oligodendrocyte.
Seti ya moduli tano zinazohusiana kwa karibu za astrocyte na microglia-tajiri (M30, M29, M18, M24, na M5) zilionyesha uwiano mzuri na neuropathology ya AD (Mchoro 2B). Uchanganuzi wa Ontolojia huunganisha moduli hizi za glial na ukuaji wa seli, kuenea, na kinga (Mchoro 2C na Jedwali S2E). Moduli mbili za ziada za glial, M8 na M22, pia zimedhibitiwa sana katika ugonjwa. M8 inahusiana sana na njia ya kipokezi cha Ushuru, mtiririko wa kuashiria ambao una jukumu muhimu katika mwitikio wa asili wa kinga (30). Wakati huo huo, M22 inahusiana kwa karibu na urekebishaji wa baada ya kutafsiri. M2, ambayo ni tajiri katika oligodendrocytes, inaonyesha uwiano mzuri na patholojia ya AD na uhusiano wa ontological na awali ya nucleoside na replication ya DNA, inayoonyesha kuongezeka kwa seli katika magonjwa. Kwa ujumla, matokeo haya yanaunga mkono mwinuko wa moduli za glial ambazo tumeona hapo awali katika proteome ya mtandao wa AD (13, 17). Kwa sasa imebainika kuwa moduli nyingi za glial zinazohusiana na AD katika mtandao zinaonyesha viwango vya chini vya kujieleza katika udhibiti na kesi za PD, zikiangazia umaalumu wao wa ugonjwa ambao umeinuliwa katika AD (Kielelezo S2C).
Moduli nne pekee katika proteome ya mtandao wetu (M1, M3, M10, na M32) zina uhusiano hasi na ugonjwa wa AD (P <0.05) (Mchoro 2, B na C). M1 na M3 zote mbili zina alama nyingi za neuronal. M1 inahusiana sana na ishara za sinepsi, wakati M3 inahusiana kwa karibu na kazi ya mitochondrial. Hakuna ushahidi wa uboreshaji wa aina ya seli kwa M10 na M32. M32 inaonyesha uhusiano kati ya M3 na kimetaboliki ya seli, wakati M10 inahusiana sana na ukuaji wa seli na utendakazi wa mikrotubuli. Ikilinganishwa na AD, moduli zote nne zinaongezwa katika udhibiti na PD, na kuwapa mabadiliko ya AD ya ugonjwa (Kielelezo S2C). Kwa ujumla, matokeo haya yanaunga mkono kupungua kwa wingi wa moduli zenye utajiri wa neuroni ambazo tumeona hapo awali katika AD (13, 17). Kwa muhtasari, uchanganuzi wa mtandao wa proteome ya ubongo ambao tuligundua ulitoa moduli zilizobadilishwa mahususi za AD kulingana na matokeo yetu ya awali.
Alzeima ina sifa ya hatua ya awali ya kutokuwa na dalili (AsymAD), ambapo watu huonyesha mkusanyiko wa amiloidi bila kupungua kwa utambuzi wa kimatibabu (5, 31). Hatua hii isiyo na dalili inawakilisha dirisha muhimu la ugunduzi wa mapema na uingiliaji kati. Hapo awali tumeonyesha uhifadhi thabiti wa msimu wa AsymAD na proteome ya mtandao wa ubongo wa AD kwenye seti huru za data (13, 17). Ili kuhakikisha kwamba mtandao wa ubongo tuliogundua sasa unalingana na matokeo haya ya awali, tulichanganua uhifadhi wa moduli 44 katika seti ya data iliyoigwa kutoka kwa mashirika 27 ya DLPFC. Mashirika haya yanajumuisha udhibiti (n = 10), AsymAD (n = 8 ) Na matukio ya AD (n = 9). Sampuli za udhibiti na AD zilijumuishwa katika uchanganuzi wa kundi letu la ubongo wa ugunduzi (Jedwali S1B), ilhali visa vya AsymAD vilikuwa vya kipekee katika kundi la replication. Kesi hizi za AsymAD pia zilitoka kwa benki ya ubongo ya Emory Goizueta ADRC. Ingawa utambuzi ulikuwa wa kawaida wakati wa kifo, viwango vya amiloidi vilikuwa vya juu isivyo kawaida (wastani wa CERAD, 2.8 ± 0.5) (Jedwali S1B).
Uchambuzi wa TMT-MS wa tishu hizi 27 za ubongo ulisababisha kuhesabiwa kwa protini 11,244. Hesabu hii ya mwisho inajumuisha tu protini zilizohesabiwa katika angalau 50% ya sampuli. Seti hii ya data iliyorudiwa ina 8638 (98.0%) ya protini 8817 zilizogunduliwa katika uchanganuzi wetu wa ubongo, na ina karibu protini 3000 zilizobadilisha kwa kiasi kikubwa kati ya udhibiti na vikundi vya AD (P <0.05, baada ya mtihani wa t uliooanishwa wa Tukey kwa uchanganuzi wa tofauti) ( Jedwali S2F). Miongoni mwa protini hizi zilizoonyeshwa kwa njia tofauti, 910 pia ilionyesha mabadiliko makubwa ya kiwango kati ya AD na kesi za udhibiti wa proteome ya ubongo (P <0.05, baada ya t-test iliyooanishwa ya ANOVA Tukey). Ni muhimu kuzingatia kwamba alama hizi 910 zinafanana sana katika mwelekeo wa mabadiliko kati ya proteomes (r = 0.94, P <1.0 × 10-200) (Mchoro S3A). Miongoni mwa protini zilizoongezeka, protini zilizo na mabadiliko thabiti zaidi kati ya seti za data ni washiriki wa moduli za M5 na M18 zenye glial (MDK, COL25A1, MAPT, NTN1, SMOC1, na GFAP). Miongoni mwa protini zilizopunguzwa, wale walio na mabadiliko thabiti zaidi walikuwa karibu wanachama pekee wa moduli ya M1 (NPTX2, VGF, na RPH3A) inayohusishwa na sinepsi. Tulithibitisha zaidi mabadiliko yanayohusiana na AD ya midkine (MDK), CD44, protini 1 inayohusiana na kuganda (SFRP1) na VGF na blotting ya magharibi (Kielelezo S3B). Uchambuzi wa kuhifadhi moduli ulionyesha kuwa takriban 80% ya moduli za protini (34/44) katika proteome ya ubongo zilihifadhiwa kwa kiasi kikubwa katika seti ya data ya urudufishaji (z-alama> 1.96, FDR iliyosahihishwa P <0.05) (Mchoro S3C). Kumi na nne kati ya moduli hizi zilihifadhiwa maalum kati ya proteomes mbili (z-alama> 10, FDR iliyosahihishwa P <1.0 × 10-23). Kwa ujumla, ugunduzi na urudufishaji wa kiwango cha juu cha uthabiti katika usemi tofauti na utungaji wa moduli kati ya proteome ya ubongo huangazia uzazi wa mabadiliko katika protini za gamba la mbele la AD. Kwa kuongeza, pia ilithibitisha kuwa AsymAD na magonjwa ya juu zaidi yana muundo sawa wa mtandao wa ubongo.
Uchanganuzi wa kina zaidi wa usemi tofauti katika seti ya data ya urudiaji wa ubongo unaonyesha kiwango kikubwa cha mabadiliko ya protini ya AsymAD, ikijumuisha jumla ya protini 151 zilizobadilishwa kwa kiasi kikubwa kati ya AsymAD na udhibiti (P <0.05) (Mchoro S3D). Sambamba na mzigo wa amiloidi, APP katika ubongo wa AsymAD na AD iliongezeka kwa kiasi kikubwa. MAPT inabadilika sana katika Alzeima, ambayo inaendana na ongezeko la viwango vya tangles na uwiano wake unaojulikana na kupungua kwa utambuzi (5, 7). Moduli zenye utajiri wa glial (M5 na M18) zinaakisiwa sana katika ongezeko la protini katika AsymAD, ilhali moduli ya M1 inayohusiana na nyuro ndiyo inayowakilisha zaidi protini zilizopungua katika AsymAD. Nyingi za alama hizi za AsymAD zinaonyesha mabadiliko makubwa zaidi katika magonjwa ya dalili. Miongoni mwa alama hizi ni SMOC1, protini ya glial ya M18, ambayo inahusishwa na uvimbe wa ubongo na ukuaji wa macho na miguu (32). MDK ni sababu ya ukuaji inayofunga heparini inayohusiana na ukuaji wa seli na angiogenesis (33), mwanachama mwingine wa M18. Ikilinganishwa na kikundi cha udhibiti, AsymAD iliongezeka kwa kiasi kikubwa, ikifuatiwa na ongezeko kubwa la AD. Kinyume chake, protini ya sinepsi neuropentraksini 2 (NPTX2) ilipunguzwa kwa kiasi kikubwa katika ubongo wa AsymAD. NPTX2 hapo awali ilihusishwa na neurodegeneration na ina jukumu linalotambuliwa katika kupatanisha sinepsi za kusisimua (34). Kwa ujumla, matokeo haya yanafichua aina mbalimbali za mabadiliko tofauti ya protini kabla ya kiafya katika Alzeima ambayo yanaonekana kuendelea na ukali wa ugonjwa.
Kwa kuzingatia kwamba tumepata kina kikubwa cha ufunikaji wa protini katika ugunduzi wa proteome ya ubongo, tunajaribu kuelewa zaidi mwingiliano wake na nukuu ya AD ya kiwango cha mtandao. Kwa hiyo, tulilinganisha proteome ya ubongo tuliyogundua na moduli tuliyozalisha hapo awali kutoka kwa kipimo cha microarray cha jeni 18,204 katika AD (n = 308) na udhibiti (n = 157) tishu za DLPFC (13). zinazopishana. Kwa jumla, tulitambua moduli 20 tofauti za RNA, ambazo nyingi zilionyesha uboreshaji wa aina maalum za seli, ikiwa ni pamoja na neurons, oligodendrocytes, astrocytes, na microglia (Mchoro 3A). Mabadiliko mengi ya moduli hizi katika AD yanaonyeshwa kwenye Mchoro 3B. Sambamba na uchanganuzi wetu wa awali wa mwingiliano wa protini-RNA kwa kutumia proteome ya MS isiyo na lebo (takriban protini 3000) (13), moduli nyingi kati ya 44 katika mtandao wa proteome za ubongo tulizopata ziko kwenye mtandao wa nukuu Hakuna mwingiliano mkubwa. ugunduzi wetu na urudufishaji wa moduli 34 za protini ambazo zimehifadhiwa sana katika proteome ya ubongo, ni 14 tu (~40%) waliofaulu mtihani kamili wa Fisher (FET) ulithibitisha kuwa na mwingiliano muhimu wa kitakwimu na nukuu (Mchoro 3A) . Inapatana na urekebishaji wa uharibifu wa DNA (P-M25 na P-M19), tafsiri ya protini (P-M7 na P-M20), kuunganisha/kuunganisha kwa RNA (P-M16 na P-M21) na kulenga protini (P-M13 na P- M23) haiingiliani na moduli kwenye nakala. Kwa hivyo, ingawa seti ya kina ya data ya proteome inatumika katika uchanganuzi wa sasa wa mwingiliano (13), proteome nyingi za mtandao wa AD hazijapangwa kwa mtandao wa nakala.
(A) Hypergeometric FET huonyesha uboreshaji wa vialamisho maalum vya aina ya seli katika moduli ya RNA ya nakala ya AD (juu) na kiwango cha mwingiliano kati ya moduli za RNA (x-axis) na protini (y-axis) za ubongo wa AD. (chini). Uzito wa utiaji mwekundu unaonyesha kiwango cha uboreshaji wa aina za seli kwenye paneli ya juu na ukubwa wa mwingiliano wa moduli kwenye paneli ya chini. Nyota zinaonyesha umuhimu wa takwimu (P <0.05). (B) Kiwango cha uwiano kati ya jeni bainishi za kila moduli ya nukuu na hali ya AD. Moduli zilizo upande wa kushoto ndizo zenye uhusiano hasi zaidi na AD (bluu), na zile za kulia ndizo zenye uhusiano mzuri zaidi na AD (nyekundu). Thamani ya P iliyobadilishwa kwa BH iliyosahihishwa inaonyesha kiwango cha umuhimu wa takwimu wa kila uwiano. (C) Moduli muhimu zinazopishana zilizo na uboreshaji wa aina ya seli iliyoshirikiwa. (D) Uchanganuzi wa uwiano wa mabadiliko ya mkunjo wa logi2 ya protini iliyo na lebo (mhimili wa x) na RNA (mhimili y) katika moduli inayopishana. Mgawo wa uunganisho wa Pearson na thamani P husika huonyeshwa. Micro, microglia; miili ya mbinguni, astrocytes. CT, udhibiti.
Moduli nyingi zinazoingiliana za protini na RNA hushiriki maelezo mafupi ya uboreshaji wa aina ya seli na maelekezo thabiti ya mabadiliko ya AD (Mchoro 3, B na C). Kwa maneno mengine, moduli ya M1 inayohusiana na sinepsi ya proteome ya ubongo (PM1) imechorwa kwa moduli tatu za RNA zenye utajiri wa neuronal (R-M1, R-M9 na R-M16), ambazo ziko katika AD Zote mbili zilionyesha. kiwango kilichopunguzwa. Vile vile, moduli za protini za M5 na M18 zenye utajiri wa glial zinaingiliana na moduli za RNA zilizojaa astrocytes na alama ndogo za microglial (R-M3, R-M7, na R-M10) na zinahusika sana katika magonjwa Ongezeko. Vipengele hivi vilivyoshirikiwa vya msimu kati ya seti mbili za data zinasaidia zaidi uboreshaji wa aina ya seli na mabadiliko yanayohusiana na magonjwa ambayo tumeona katika proteome ya ubongo. Hata hivyo, tuliona tofauti nyingi muhimu kati ya viwango vya RNA na protini vya vialamisho binafsi katika moduli hizi zilizoshirikiwa. Uchanganuzi wa uwiano wa usemi tofauti wa proteomics na nukuu za molekuli ndani ya moduli hizi zinazopishana (Kielelezo 3D) huangazia utofauti huu. Kwa mfano, APP na protini nyingine nyingi za moduli ya glial (NTN1, MDK, COL25A1, ICAM1, na SFRP1) zilionyesha ongezeko kubwa la proteome ya AD, lakini karibu hakuna mabadiliko katika nakala ya AD. Mabadiliko haya mahususi ya protini yanaweza kuwa yanahusiana kwa karibu na alama za amiloidi (23, 35), yakiangazia proteome kama chanzo cha mabadiliko ya kiafya, na mabadiliko haya hayawezi kuonyeshwa kwenye nakala.
Baada ya kuchambua kwa kujitegemea ubongo na proteome za CSF tulizogundua, tulifanya uchambuzi wa kina wa seti mbili za data ili kutambua alama za bioalama za AD CSF zinazohusiana na pathofiziolojia ya mtandao wa ubongo. Lazima kwanza tufafanue mwingiliano wa proteomu mbili. Ingawa inakubalika sana kuwa CSF huakisi mabadiliko ya nyurokemikali katika ubongo wa AD (4), kiwango kamili cha mwingiliano kati ya ubongo wa AD na proteome ya CSF haijulikani. Kwa kulinganisha idadi ya bidhaa za jeni zilizoshirikiwa zilizogunduliwa katika proteome zetu mbili, tuligundua kuwa karibu 70% (n = 1936) ya protini zilizoainishwa kwenye giligili ya ubongo pia zilihesabiwa kwenye ubongo (Mchoro 4A). Nyingi za protini hizi zinazopishana (n = 1721) zimechorwa kwa mojawapo ya moduli 44 za usemi-mwenza kutoka kwa seti ya data ya ubongo ya ugunduzi (Mchoro 4B). Kama inavyotarajiwa, moduli sita kubwa zaidi za ubongo (M1 hadi M6) zilionyesha kiwango kikubwa zaidi cha mwingiliano wa CSF. Hata hivyo, kuna moduli ndogo za ubongo (kwa mfano, M15 na M29) ambazo zinafikia kiwango cha juu cha kuingiliana bila kutarajia, kubwa kuliko moduli ya ubongo mara mbili ya ukubwa wake. Hili hutuhamasisha kutumia mbinu ya kina zaidi, inayoendeshwa na takwimu ili kukokotoa mwingiliano kati ya ubongo na ugiligili wa ubongo.
(A na B) Protini zilizogunduliwa katika ubongo wa uvumbuzi na seti za data za CSF zinapishana. Nyingi za protini hizi zinazoingiliana zinahusishwa na mojawapo ya moduli 44 za usemi-shirikishi za mtandao wa usemi-ushirikiano wa ubongo. (C) Gundua mwingiliano kati ya proteome ya ugiligili wa ubongo na proteome ya mtandao wa ubongo. Kila safu mlalo ya ramani ya joto inawakilisha uchanganuzi tofauti wa mwingiliano wa FET ya kijiometri. Safu mlalo ya juu inaonyesha mwingiliano (kivuli cha kijivu/nyeusi) kati ya moduli ya ubongo na proteome nzima ya CSF. Mstari wa pili unaonyesha kwamba mwingiliano kati ya moduli za ubongo na protini ya CSF (iliyotiwa kivuli katika nyekundu) imedhibitiwa kwa kiasi kikubwa katika AD (P <0.05). Safu ya tatu inaonyesha kuwa mwingiliano kati ya moduli za ubongo na protini ya CSF (kivuli cha bluu) hudhibitiwa kwa kiasi kikubwa katika AD (P <0.05). Tumia njia ya BH kusahihisha thamani ya P inayotokana na FET. (D) Paneli ya moduli ya kukunja kulingana na uhusiano wa aina ya seli na masharti husika ya GO. Paneli hizi zina jumla ya protini 271 zinazohusiana na ubongo, ambazo zina usemi wa maana tofauti katika proteome ya CSF.
Kwa kutumia FET zenye mkia mmoja, tulitathmini umuhimu wa mwingiliano wa protini kati ya proteome ya CSF na moduli za ubongo za mtu binafsi. Uchanganuzi ulibaini kuwa jumla ya moduli 14 za ubongo katika seti ya data ya CSF zina mwingiliano muhimu wa kitakwimu (FDR iliyorekebishwa P <0.05), na moduli ya ziada (M18) ambayo mwingiliano wake unakaribia umuhimu (FDR iliyorekebishwa P = 0.06) (Mchoro 4C , safu ya juu). Pia tunavutiwa na moduli ambazo zinaingiliana sana na protini za CSF zilizoonyeshwa kwa njia tofauti. Kwa hivyo, tulitumia uchanganuzi mbili za ziada za FET ili kubaini ni ipi kati ya (i) protini ya CSF iliongezwa kwa kiasi kikubwa katika AD na (ii) protini ya CSF ilipungua kwa kiasi kikubwa katika AD (P <0.05, t paired t mtihani AD/control) moduli za ubongo zilizo na mwingiliano wa maana. kati yao. Kama inavyoonyeshwa katika safu mlalo za kati na za chini za Mchoro 4C, uchanganuzi huu wa ziada unaonyesha kuwa moduli 8 kati ya 44 za ubongo zinaingiliana kwa kiasi kikubwa na protini iliyoongezwa katika AD CSF (M12, M1, M2, M18, M5, M44, M33, na M38) . ), wakati moduli mbili tu (M6 na M15) zilionyesha mwingiliano wa maana na protini iliyopunguzwa katika AD CSF. Kama inavyotarajiwa, moduli zote 10 ziko katika moduli 15 zenye mwingiliano wa juu zaidi na proteome ya CSF. Kwa hivyo, tunadhania kwamba moduli hizi 15 ni vyanzo vya mavuno ya juu vya alama za bioalama za CSF zinazotokana na ubongo za AD.
Tulikunja moduli hizi 15 zinazopishana katika paneli tano kubwa za protini kulingana na ukaribu wake katika mchoro wa mti wa WGCNA na uhusiano wake na aina za seli na ontolojia ya jeni (Mchoro 4D). Jopo la kwanza lina moduli zenye alama za neuroni na protini zinazohusiana na sinepsi (M1 na M12). Paneli ya sinepsi ina jumla ya protini 94, na viwango katika proteome ya CSF vimebadilika kwa kiasi kikubwa, na kuifanya kuwa chanzo kikubwa zaidi cha alama za CSF zinazohusiana na ubongo kati ya paneli tano. Kundi la pili (M6 na M15) lilionyesha uhusiano wa karibu na alama za seli za endothelial na mwili wa mishipa, kama vile "uponyaji wa jeraha" (M6) na "udhibiti wa majibu ya kinga ya humoral" (M15). M15 pia inahusiana sana na kimetaboliki ya lipoprotein, ambayo inahusiana sana na endothelium (36). Paneli ya mishipa ina alama 34 za CSF zinazohusiana na ubongo. Kundi la tatu linajumuisha moduli (M2 na M4) ambazo zinahusiana sana na alama za oligodendrocyte na kuenea kwa seli. Kwa mfano, masharti ya ontolojia ya kiwango cha juu ya M2 yanajumuisha "udhibiti chanya wa urudufishaji wa DNA" na "mchakato wa biosynthesis ya purine". Wakati huo huo, wale wa M4 ni pamoja na "utofauti wa seli za glial" na "utengano wa kromosomu". Paneli ya myelination ina alama 49 za CSF zinazohusiana na ubongo.
Kundi la nne lina moduli nyingi (M30, M29, M18, M24, na M5), na karibu moduli zote zina utajiri mkubwa wa alama za microglia na astrocyte. Sawa na paneli ya uhamishaji miyelini, paneli ya nne pia ina moduli (M30, M29, na M18) ambazo zinahusiana kwa karibu na kuenea kwa seli. Moduli nyingine katika kikundi hiki zinahusiana sana na maneno ya kingamwili, kama vile "mchakato wa athari za kinga" (M5) na "udhibiti wa majibu ya kinga" (M24). Kikundi cha kinga cha glial kina alama 42 za CSF zinazohusiana na ubongo. Hatimaye, jopo la mwisho linajumuisha alama 52 zinazohusiana na ubongo kwenye moduli nne (M44, M3, M33, na M38), ambazo zote ziko kwenye mwili zinazohusiana na uhifadhi wa nishati na kimetaboliki. Kubwa zaidi ya moduli hizi (M3) inahusiana kwa karibu na mitochondria na ina alama nyingi za neuroni mahususi. M38 ni mmoja wa washiriki wa moduli ndogo katika metabolome hii na pia inaonyesha umaalum wa wastani wa neuroni.
Kwa ujumla, paneli hizi tano zinaonyesha anuwai ya aina na utendaji wa seli katika gamba la AD, na kwa pamoja huwa na vialamisho 271 vya CSF vinavyohusiana na ubongo (Jedwali S2G). Ili kutathmini uhalali wa matokeo haya ya MS, tulitumia kipimo cha upanuzi wa ukaribu (PEA), teknolojia ya msingi ya kingamwili ya orthogonal yenye uwezo wa kuzidisha, unyeti wa juu na umaalum, na tukachambua upya sampuli za ugiligili wa ubongo tulipata Seti ndogo ya alama hizi 271. (n = 36). Malengo haya 36 yanaonyesha mabadiliko katika wingi wa AD ya PEA, ambayo inahusiana kwa karibu na matokeo yetu ya msingi ya MS (r = 0.87, P = 5.6 × 10-12) , Ambayo ilithibitisha kwa nguvu matokeo ya uchanganuzi wetu wa kina wa MS (Mchoro S4). )
Mandhari ya kibiolojia yaliyosisitizwa na vikundi vyetu vitano, kutoka kwa ishara ya sinepsi hadi kimetaboliki ya nishati, yote yanahusiana na pathogenesis ya AD (1-3). Kwa hiyo, moduli zote 15 zilizo na paneli hizi zinahusiana na ugonjwa wa AD katika proteome ya ubongo ambayo tuligundua (Mchoro 2B). Kinachojulikana zaidi ni uwiano wa hali ya juu wa kiafya kati ya moduli zetu za glial na uunganisho mkubwa hasi wa kiafya kati ya moduli zetu kubwa zaidi za neuronal (M1 na M3). Uchanganuzi wa usemi tofauti wa proteome ya ubongo iliyorudiwa (Kielelezo S3D) pia huangazia protini za glial zinazotokana na M5 na M18. Katika AsymAD na AD ya dalili, protini za glial zilizoongezeka zaidi na sinepsi zinazohusiana na M1 Protini hupunguzwa zaidi. Uchunguzi huu unaonyesha kwamba alama 271 za ugiligili wa ubongo tulizozibainisha katika makundi matano zinahusiana na michakato ya ugonjwa katika gamba la AD, ikiwa ni pamoja na zile zinazotokea katika hatua za awali zisizo na dalili.
Ili kuchanganua vyema mwelekeo wa mabadiliko ya paneli za protini kwenye ubongo na giligili ya uti wa mgongo, tulichora yafuatayo kwa kila moduli 15 zinazoingiliana: (i) tulipata kiwango cha wingi wa moduli katika seti ya data ya ubongo na (ii) moduli. protini Tofauti inaonyeshwa katika maji ya cerebrospinal (Mchoro S5). Kama ilivyoelezwa hapo awali, WGCNA hutumiwa kuamua wingi wa moduli au thamani ya protini kwenye ubongo (13). Ramani ya volcano inatumika kuelezea usemi tofauti wa protini za msimu katika ugiligili wa ubongo (AD/control). Takwimu hizi zinaonyesha kuwa paneli tatu kati ya tano zinaonyesha mwelekeo tofauti wa kujieleza katika ubongo na maji ya uti wa mgongo. Moduli mbili za paneli ya sinepsi (M1 na M12) zinaonyesha kupungua kwa kiwango cha wingi katika ubongo wa AD, lakini kwa kiasi kikubwa huingiliana na protini iliyoongezeka katika AD CSF (Kielelezo S5A). Moduli zinazohusiana na nyuro zilizo na metabolome (M3 na M38) zilionyesha mwelekeo sawa wa usemi wa ugiligili wa ubongo na ugiligili wa ubongo (Mchoro S5E). Jopo la mishipa pia lilionyesha mwelekeo tofauti wa kujieleza, ingawa moduli zake (M6 na M15) ziliongezeka kwa kiasi katika ubongo wa AD na kupungua kwa CSF ya ugonjwa (Kielelezo S5B). Paneli mbili zilizobaki zina mitandao mikubwa ya glial ambayo protini zake zimedhibitiwa mara kwa mara katika sehemu zote mbili (Mchoro S5, C na D).
Tafadhali kumbuka kuwa mitindo hii si ya kawaida kwa vialamisho vyote kwenye paneli hizi. Kwa mfano, paneli ya sinepsi inajumuisha protini kadhaa ambazo zimepunguzwa kwa kiasi kikubwa katika ubongo wa AD na CSF (Kielelezo S5A). Miongoni mwa alama hizi za ugiligili wa ubongo zilizodhibitiwa chini ni NPTX2 na VGF ya M1, na chromogranin B ya M12. Hata hivyo, licha ya vighairi hivi, alama zetu nyingi za sinepsi zimeinuliwa katika ugiligili wa mgongo wa AD. Kwa ujumla, uchanganuzi huu uliweza kutofautisha mwelekeo muhimu wa kitakwimu katika viwango vya ubongo na ugiligili wa ubongo katika kila paneli zetu tano. Mitindo hii inaangazia uhusiano changamano na mara nyingi tofauti kati ya ubongo na usemi wa protini ya CSF katika AD.
Kisha, tulitumia uchanganuzi wa urudufishaji wa MS wa kiwango cha juu (CSF replication 1) ili kupunguza seti yetu 271 ya viashirio vya kibayolojia hadi malengo ya kuahidi na yanayoweza kuzaliana (Mchoro 5A). Nakala 1 ya CSF ina jumla ya sampuli 96 kutoka Emory Goizueta ADRC, ikijumuisha udhibiti, AsymAD, na kundi la AD (Jedwali S1A). Visa hivi vya Alzeima vina sifa ya kupungua kidogo kwa utambuzi (wastani wa MoCA, 20.0 ± 3.8), na mabadiliko katika vialama vya AD vilivyothibitishwa katika ugiligili wa ubongo (Jedwali S1A). Kinyume na uchanganuzi wa CSF tuliopata, urudufishaji huu unafanywa kwa kutumia mbinu bora zaidi na ya hali ya juu ya "risasi moja" ya MS (bila kugawanyika nje ya mtandao), ikijumuisha itifaki iliyorahisishwa ya utayarishaji wa sampuli ambayo huondoa hitaji la upungufu wa kinga ya sampuli za mtu binafsi. . Badala yake, "chaneli ya uboreshaji" iliyopunguzwa kinga moja hutumiwa kukuza ishara ya protini nyingi (37). Ingawa inapunguza ufunikaji wa jumla wa proteome, mbinu hii ya kupiga picha moja hupunguza kwa kiasi kikubwa muda wa mashine na huongeza idadi ya sampuli zenye lebo ya TMT ambazo zinaweza kuchanganuliwa kuwa zinafaa (17, 38). Kwa jumla, uchanganuzi uligundua peptidi 6,487, ambazo ziliweka proteni 1,183 katika visa 96. Kama ilivyo kwa uchanganuzi wa CSF tuliopata, ni protini zile tu zilizohesabiwa katika angalau 50% ya sampuli zilizojumuishwa katika hesabu zilizofuata, na data ilirejeshwa kwa athari za umri na jinsia. Hii ilisababisha kuhesabiwa kwa mwisho kwa protini 792, 95% ambazo pia zilitambuliwa katika seti ya data ya CSF iliyopatikana.
(A) Malengo ya protini ya CSF yanayohusiana na ubongo yamethibitishwa katika kundi la kwanza la CSF lililoigwa na kujumuishwa kwenye paneli ya mwisho (n = 60). (B hadi E) Viwango vya paneli vya alama za kibayolojia (alama z-composite) hupimwa katika vikundi vinne vya urudufishaji vya CSF. Majaribio ya t yaliyooanishwa au ANOVA yenye urekebishaji baada ya Tukey ilitumiwa kutathmini umuhimu wa takwimu wa mabadiliko mengi katika kila uchanganuzi wa nakala. CT, udhibiti.
Kwa kuwa tuna nia hasa ya kuthibitisha shabaha zetu 271 za CSF zinazohusiana na ubongo kupitia uchanganuzi wa kina, tutapunguza uchunguzi zaidi wa proteome hii iliyoigwa kwa vialamisho hivi. Miongoni mwa protini hizi 271, 100 ziligunduliwa katika urudufishaji wa CSF 1. Kielelezo S6A kinaonyesha usemi tofauti wa alama hizi 100 zinazopishana kati ya udhibiti na sampuli za urudufishaji wa AD. Histoni za synaptic na metabolite huongeza zaidi katika AD, wakati protini za mishipa hupungua zaidi katika ugonjwa. Wengi wa alama 100 zinazoingiliana (n = 70) zilidumisha mwelekeo sawa wa mabadiliko katika seti mbili za data (Kielelezo S6B). Alama hizi 70 zilizoidhinishwa za CSF zinazohusiana na ubongo (Jedwali S2H) kwa kiasi kikubwa huakisi mitindo ya usemi wa paneli iliyozingatiwa hapo awali, yaani, udhibiti wa chini wa protini za mishipa na udhibiti wa juu wa paneli zingine zote. Protini 10 pekee kati ya 70 zilizoidhinishwa zilionyesha mabadiliko katika wingi wa AD ambayo yalipinga mitindo hii ya paneli. Ili kutengeneza kidirisha kinachoakisi vyema zaidi mwelekeo wa jumla wa ubongo na ugiligili wa ubongo, tuliondoa protini hizi 10 kwenye kidirisha cha mambo yanayokuvutia ambacho hatimaye tulithibitisha (Mchoro 5A). Kwa hivyo, kidirisha chetu hatimaye kinajumuisha jumla ya protini 60 zilizothibitishwa katika makundi mawili huru ya CSF AD kwa kutumia utayarishaji wa sampuli tofauti na uchanganuzi wa jukwaa la MS. Mipangilio ya vielelezo vya z-alama ya vidirisha hivi vya mwisho katika kidhibiti cha nakala 1 cha CSF na visa vya AD vilithibitisha mwelekeo wa paneli uliozingatiwa katika kundi la CSF tulilopata (Mchoro 5B).
Miongoni mwa protini hizi 60, kuna molekuli zinazojulikana kuhusishwa na Alzeima, kama vile osteopontin (SPP1), ambayo ni saitokini inayochochea uchochezi ambayo imehusishwa na AD katika tafiti nyingi (39-41), na GAP43, protini ya sinepsi. kwamba ni wazi wanaohusishwa na neurodegeneration (42). Protini zilizothibitishwa kikamilifu ni viashirio vinavyohusiana na magonjwa mengine ya mfumo wa neva, kama vile amyotrophic lateral sclerosis (ALS) inayohusiana na superoxide dismutase 1 (SOD1) na desaccharase inayohusiana na ugonjwa wa Parkinson (PARK7). Pia tumethibitisha kuwa vialamisho vingine vingi, kama vile SMOC1 na viambatisho vya utando wa ubongo wenye utajiri mkubwa unaoashiria protini 1 (BASP1), vimedhibiti viungo vya awali vya kuzorota kwa mfumo wa neva. Inafaa kukumbuka kuwa kwa sababu ya wingi wao mdogo katika proteome ya CSF, ni vigumu kwetu kutumia mbinu hii ya utambuzi wa risasi moja ya kiwango cha juu ili kugundua kwa uhakika MAPT na baadhi ya protini nyingine zinazohusiana na AD (kwa mfano, NEFL na NRGN). ) ( 43, 44).
Kisha tuliangalia alama hizi 60 za vipaumbele vya vibao katika uchanganuzi tatu wa ziada wa kunakili. Katika CSF Copy 2, tulitumia TMT-MS moja kuchanganua kundi huru la vidhibiti 297 na sampuli za AD kutoka Emory Goizueta ADRC (17). CSF replication 3 ni pamoja na uchambuzi upya wa data inapatikana TMT-MS kutoka 120 kudhibiti na AD wagonjwa kutoka Lausanne, Uswisi (45). Tuligundua zaidi ya theluthi mbili ya alama 60 za kipaumbele katika kila mkusanyiko. Ingawa utafiti wa Uswisi ulitumia mifumo tofauti ya MS na mbinu za ukadiriaji za TMT (45, 46), tulitoa tena mienendo yetu ya paneli katika uchanganuzi unaorudiwa mara mbili (Mchoro 5, C na D, na Jedwali S2, I, na J) . Ili kutathmini umaalum wa ugonjwa wa kikundi chetu, tulitumia TMT-MS kuchambua seti ya nne ya data ya replication (CSF replication 4), ambayo ilijumuisha sio tu udhibiti (n = 18) na AD (n = 17) kesi, lakini pia PD ( n = 14)), ALS (n = 18) na sampuli za shida ya akili ya frontotemporal (FTD) (n = 11) (Jedwali S1A). Tulikadiria kwa ufanisi karibu theluthi mbili ya protini za paneli katika kundi hili (38 kati ya 60). Matokeo haya yanaonyesha mabadiliko mahususi ya AD katika paneli zote tano za alama za kibayolojia (Mchoro 5E na Jedwali S2K). Ongezeko la kikundi cha metabolite lilionyesha umaalumu mkubwa wa AD, ikifuatiwa na kikundi cha miyelination na glial. Kwa kiasi kidogo, FTD pia inaonyesha ongezeko kati ya paneli hizi, ambayo inaweza kutafakari mabadiliko yanayowezekana ya mtandao (17). Kinyume chake, ALS na PD zilionyesha karibu wasifu sawa wa myelination, glial, na metabolome kama kikundi cha udhibiti. Kwa ujumla, licha ya tofauti katika utayarishaji wa sampuli, mfumo wa MS, na mbinu za ukadiriaji za TMT, uchanganuzi huu unaorudiwa unaonyesha kuwa vialamisho vya paneli za kipaumbele vina mabadiliko thabiti ya AD-mahususi katika zaidi ya sampuli 500 za kipekee za CSF.
Uharibifu wa neurodegeneration ya AD umetambuliwa sana miaka kadhaa kabla ya kuanza kwa dalili za utambuzi, kwa hivyo kuna hitaji la haraka la viashirio vya kibayolojia vya AsymAD (5, 31). Walakini, ushahidi zaidi na zaidi unaonyesha kuwa biolojia ya AsymAD iko mbali na usawa, na mwingiliano mgumu wa hatari na ustahimilivu husababisha tofauti kubwa za mtu binafsi katika maendeleo ya ugonjwa unaofuata (47). Ingawa hutumiwa kutambua visa vya AsymAD, viwango vya viashirio vikuu vya CSF (Aβ1-42, tau jumla na p-tau) havijathibitisha kuwa na uwezo wa kutabiri kwa uhakika ni nani atakayeendelea na ugonjwa wa shida ya akili (4, 7), ikionyesha zaidi. muhimu kujumuisha zana za jumla za alama za kibayolojia kulingana na vipengele vingi vya fiziolojia ya ubongo ili kuainisha kwa usahihi hatari ya watu hawa. Kwa hivyo, baadaye tulichanganua paneli yetu ya alama za kibayolojia iliyoidhinishwa na AD katika idadi ya watu wa AsymAD ya nakala 1 ya CSF. Kesi hizi 31 za AsymAD zilionyesha viwango visivyo vya kawaida vya alama za kibayolojia (Aβ1–42/jumla ya uwiano wa ELISA, <5.5) na utambuzi kamili (maana ya MoCA, 27.1). ± 2.2) (Jedwali S1A). Kwa kuongezea, watu wote walio na AsymAD wana alama ya kliniki ya shida ya akili ya 0, kuonyesha kwamba hakuna ushahidi wa kupungua kwa utendaji wa kila siku wa utambuzi au utendaji.
Kwanza tulichanganua viwango vya vidirisha vilivyoidhinishwa katika nakala zote 96 za CSF 1, ikijumuisha kundi la AsymAD. Tuligundua kuwa paneli kadhaa katika kundi la AsymAD zilikuwa na mabadiliko makubwa ya AD-kama wingi, paneli ya mishipa ilionyesha mwelekeo wa kushuka katika AsymAD, wakati paneli nyingine zote zilionyesha mwelekeo wa juu (Mchoro 6A). Kwa hiyo, paneli zote zilionyesha uwiano muhimu sana na ELISA Aβ1-42 na viwango vya jumla vya tau (Mchoro 6B). Kinyume chake, uwiano kati ya kikundi na alama ya MoCA ni duni. Mojawapo ya matokeo ya kuvutia zaidi kutoka kwa uchanganuzi huu ni anuwai kubwa ya paneli katika kundi la AsymAD. Kama inavyoonyeshwa kwenye Mchoro 6A, kiwango cha paneli cha kikundi cha AsymAD kwa kawaida huvuka kiwango cha paneli cha kikundi dhibiti na kikundi cha AD, ikionyesha utofauti wa juu kiasi. Ili kuchunguza zaidi utofauti huu wa AsymAD, tulitumia uchanganuzi wa Multidimensional Scaling (MDS) kwa kesi 96 za CSF replication 1. Uchambuzi wa MDS unaruhusu kuibua mfanano kati ya kesi kulingana na vigeu fulani katika seti ya data. Kwa uchanganuzi huu wa kundi, tunatumia tu alama za paneli zilizoidhinishwa ambazo zina mabadiliko makubwa kitakwimu (P <0.05, AD/control) katika kiwango cha ugunduzi wa CSF na urudufishaji 1 wa proteome (n = 29) (Jedwali S2L). Uchanganuzi huu ulizalisha nguzo wazi za anga kati ya udhibiti wetu na kesi za AD (Mchoro 6C). Kinyume chake, baadhi ya visa vya AsymAD vimeunganishwa kwa uwazi katika kikundi cha udhibiti, ilhali vingine viko katika visa vya AD. Ili kuchunguza zaidi utofauti huu wa AsymAD, tulitumia ramani yetu ya MDS kufafanua vikundi viwili vya visa hivi vya AsymAD. Kundi la kwanza lilijumuisha kesi za AsymAD zilizounganishwa karibu na udhibiti (n = 19), wakati kundi la pili lilikuwa na matukio ya AsymAD yenye wasifu wa alama karibu na AD (n = 12).
(A) Kiwango cha usemi (z-alama) cha kikundi cha alama za kibayolojia cha CSF katika sampuli zote 96 katika kundi 1 la replication la CSF, ikijumuisha AsymAD. Uchanganuzi wa tofauti na urekebishaji baada ya Tukey ulitumika kutathmini umuhimu wa takwimu wa mabadiliko ya wingi wa paneli. (B) Uchanganuzi wa uwiano wa kiwango cha wingi wa protini ya paneli (z-alama) na alama ya MoCA na jumla ya kiwango cha tau katika ELISA Aβ1-42 na sampuli 1 za CSF. Mgawo wa uunganisho wa Pearson na thamani P husika huonyeshwa. (C) MDS ya kesi 96 za nakala 1 za CSF zilitokana na viwango vya wingi wa alama 29 za paneli zilizoidhinishwa, ambazo zilibadilishwa kwa kiasi kikubwa katika ugunduzi na seti za data za CSF 1 [P <0.05 AD/control (CT)]. Uchambuzi huu ulitumiwa kugawanya kikundi cha AsymAD katika udhibiti (n = 19) na AD (n = 12) vikundi vidogo. (D) Mpangilio wa volcano unaonyesha usemi tofauti wa protini zote za CSF replication 1 zilizo na mabadiliko ya mkunjo wa log2 (x-axis) ikilinganishwa na thamani ya -log10 ya takwimu kati ya vikundi viwili vya AsymAD. Alama za kibaolojia za paneli zimepakwa rangi. (E) CSF replication 1 wingi ngazi ya biomarker kundi uteuzi ni tofauti kati ya AsymAD subgroups. Uchanganuzi wa Tukey uliorekebishwa wa tofauti ulitumiwa kutathmini umuhimu wa takwimu.
Tulichunguza usemi wa protini tofauti kati ya udhibiti huu na visa vya AD-kama vya AsymAD (Mchoro 6D na Jedwali S2L). Matokeo ya ramani ya volcano inaonyesha kuwa alama za paneli 14 zimebadilika sana kati ya vikundi viwili. Wengi wa alama hizi ni wanachama wa sinepsi na metabolome. Hata hivyo, sehemu ndogo ya SOD1 na myristoylated alanine-tajiri ya kinase C ya protini kinase C (MARCKS), ambayo ni wanachama wa makundi ya kinga ya myelin na glial, kwa mtiririko huo, pia ni ya kundi hili (Mchoro 6, D na E) . Paneli ya mishipa pia ilichangia alama mbili ambazo zilipunguzwa kwa kiasi kikubwa katika kikundi cha AD-kama AsymAD, ikiwa ni pamoja na AE kumfunga protini 1 (AEBP1) na inayosaidia mwanafamilia C9. Hakukuwa na tofauti kubwa kati ya udhibiti na vikundi vidogo vya AD-kama AsymAD katika ELISA AB1-42 (P = 0.38) na p-tau (P = 0.28), lakini kwa kweli kulikuwa na tofauti kubwa katika kiwango cha jumla cha tau (P = 0.0031 ) (Mchoro S7). Kuna alama za paneli kadhaa ambazo zinaonyesha kuwa mabadiliko kati ya vikundi vidogo viwili vya AsymAD ni muhimu zaidi kuliko viwango vya jumla vya tau (kwa mfano, YWHAZ, SOD1, na MDH1) (Mchoro 6E). Kwa ujumla, matokeo haya yanaonyesha kuwa kidirisha chetu kilichoidhinishwa kinaweza kuwa na alama za kibayolojia ambazo zinaweza kuweka aina ndogo na uwezekano wa utabaka wa hatari wa wagonjwa walio na ugonjwa usio na dalili.
Kuna hitaji la dharura la zana za alama za kibayolojia kulingana na mfumo ili kupima vyema na kulenga patholojia mbalimbali nyuma ya AD. Zana hizi zinatarajiwa sio tu kubadilisha mfumo wetu wa uchunguzi wa Alzeima, lakini pia kukuza upitishwaji wa mikakati madhubuti ya matibabu mahususi ya mgonjwa (1, 2). Ili kufikia lengo hili, tulitumia mbinu ya kina ya proteomics isiyopendelea kwa ubongo wa AD na CSF ili kutambua viambulisho vya msingi vya CSF vinavyoakisi anuwai ya patholojia inayotegemea ubongo. Uchambuzi wetu ulitoa paneli tano za alama za kibayolojia za CSF, ambazo (i) zinaonyesha sinepsi, mishipa ya damu, myelini, kutofanya kazi kwa kinga na kimetaboliki; (ii) kuonyesha uwezo wa kuzaliana tena kwenye mifumo tofauti ya MS; ( iii) Onyesha mabadiliko yanayoendelea ya ugonjwa katika hatua zote za mwanzo na za mwisho za Alzeima. Kwa ujumla, matokeo haya yanawakilisha hatua ya kuahidi kuelekea uundaji wa zana mbalimbali, za kuaminika, za alama za kibayolojia zinazoelekezwa kwenye wavuti kwa ajili ya utafiti wa AD na matumizi ya kimatibabu.
Matokeo yetu yanaonyesha shirika lililohifadhiwa sana la proteome ya mtandao wa ubongo wa AD na kuunga mkono matumizi yake kama msingi wa ukuzaji wa alama za kibayolojia kulingana na mfumo. Uchanganuzi wetu unaonyesha kuwa hifadhidata mbili huru za TMT-MS zilizo na akili za AD na AsymAD zina moduli dhabiti. Matokeo haya yanapanua kazi yetu ya awali, ikionyesha uhifadhi wa moduli zenye nguvu za zaidi ya tishu 2,000 za ubongo kutoka kwa vikundi vingi vya kujitegemea kwenye gamba la mbele, la parietali, na la muda (17). Mtandao huu wa maafikiano unaonyesha mabadiliko mbalimbali yanayohusiana na magonjwa yaliyozingatiwa katika utafiti wa sasa, ikiwa ni pamoja na ongezeko la moduli za uchochezi zenye glial na kupungua kwa moduli zenye utajiri wa neuroni. Kama utafiti wa sasa, mtandao huu wa kiwango kikubwa pia unaangazia mabadiliko makubwa ya msimu katika AsymAD, kuonyesha anuwai ya ugonjwa wa ugonjwa wa mapema (17).
Hata hivyo, ndani ya mfumo huu wa msingi wa kihafidhina wa hali ya juu, kuna utofauti wa kibayolojia ulioboreshwa zaidi, hasa miongoni mwa watu binafsi katika hatua za mwanzo za Alzeima. Paneli yetu ya alama za kibayolojia inaweza kuonyesha vikundi viwili vidogo katika AsymAD, ambavyo vinaonyesha usemi muhimu wa tofauti wa vialamisho vingi vya CSF. Kikundi chetu kiliweza kuangazia tofauti za kibayolojia kati ya vikundi hivi viwili vidogo, ambavyo havikuwa dhahiri katika kiwango cha alama za msingi za AD. Ikilinganishwa na kikundi cha udhibiti, uwiano wa Aβ1-42/jumla ya tau ya watu hawa wa AsymAD ulikuwa chini isivyo kawaida. Hata hivyo, ni viwango vya jumla vya tau pekee vilivyokuwa tofauti sana kati ya vikundi vidogo viwili vya AsymAD, ilhali viwango vya Aβ1-42 na p-tau vilibakia kulinganishwa. Kwa kuwa tau ya juu ya CSF inaonekana kuwa kitabiri bora cha dalili za utambuzi kuliko viwango vya Aβ1-42 (7), tunashuku kuwa makundi mawili ya AsymAD yanaweza kuwa na hatari tofauti za kuendelea kwa ugonjwa. Kwa kuzingatia ukubwa mdogo wa sampuli ya AsymAD yetu na ukosefu wa data ya longitudinal, utafiti zaidi unahitajika ili kufikia hitimisho hili kwa ujasiri. Hata hivyo, matokeo haya yanaonyesha kuwa paneli ya mfumo wa CSF inaweza kuimarisha uwezo wetu wa kuwatenganisha watu kwa ufanisi wakati wa hatua isiyo na dalili ya ugonjwa.
Kwa ujumla, matokeo yetu yanaunga mkono jukumu la kazi nyingi za kibiolojia katika pathogenesis ya AD. Hata hivyo, kimetaboliki ya nishati isiyodhibitiwa ikawa mada kuu ya paneli zetu zote tano za uwekaji lebo zilizoidhinishwa. Protini za kimetaboliki, kama vile hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1) na lactate dehydrogenase A (LDHA), ndizo alama za bioalama za sinepsi zilizoidhinishwa kwa nguvu zaidi, ikionyesha kuwa ongezeko la AD CSF ni ngono inayoweza kuzaliana tena. Mishipa yetu ya damu na paneli za glial pia zina alama kadhaa zinazohusika katika metaboli ya vitu vya oksidi. Matokeo haya yanaendana na jukumu muhimu ambalo michakato ya kimetaboliki inacheza katika ubongo mzima, sio tu kukidhi mahitaji ya juu ya nishati ya niuroni, lakini pia kukidhi mahitaji ya juu ya nishati ya astrocytes na seli zingine za glial (17, 48). Matokeo yetu yanaunga mkono ushahidi unaokua kwamba mabadiliko katika uwezekano wa redox na usumbufu wa njia za nishati inaweza kuwa kiungo cha msingi kati ya michakato kadhaa muhimu inayohusika katika pathogenesis ya AD, ikiwa ni pamoja na matatizo ya mitochondrial, kuvimba kwa glial, na uharibifu wa Mishipa (49). Zaidi ya hayo, viashirio vya ugiligili wa uti wa mgongo wa kimetaboliki vina idadi kubwa ya protini tajiri tofauti kati ya udhibiti wetu na vikundi vidogo vya AD-kama vya AsymAD, na hivyo kupendekeza kwamba usumbufu wa njia hizi za nishati na redox unaweza kuwa muhimu katika hatua ya awali ya ugonjwa.
Mitindo tofauti ya paneli ya kiowevu cha ubongo na uti wa mgongo ambayo tumeona pia ina athari za kibayolojia zinazovutia. Synapses na metabolomes zenye niuroni huonyesha viwango vilivyopungua katika ubongo wa AD na kuongezeka kwa wingi katika ugiligili wa ubongo. Kwa kuzingatia kwamba niuroni ni tajiri katika mitochondria inayozalisha nishati kwenye sinepsi ili kutoa nishati kwa ishara zao nyingi maalum (50), kufanana kwa wasifu wa usemi wa vikundi hivi viwili vya niuroni unatarajiwa. Hasara ya neurons na extrusion ya seli kuharibiwa inaweza kueleza haya ubongo na CSF jopo mwelekeo katika ugonjwa wa baadaye, lakini hawawezi kueleza mabadiliko ya jopo mapema sisi kuona (13). Sababu moja inayowezekana ya matokeo haya katika ugonjwa wa mapema usio na dalili ni upogoaji usio wa kawaida wa sinepsi. Ushahidi mpya katika mifano ya panya unaonyesha kwamba phagocytosis ya sinepsi ya microglia-mediated inaweza kuanzishwa kwa njia isiyo ya kawaida katika AD na kusababisha hasara ya mapema ya sinepsi katika ubongo (51). Nyenzo hii ya sinepsi iliyotupwa inaweza kukusanyika katika CSF, ndiyo maana tunaona ongezeko la CSF kwenye paneli ya niuroni. Upogoaji wa sinepsi unaopatana na kinga unaweza pia kueleza kwa kiasi ongezeko la protini za glial tunazoona kwenye ubongo na ugiligili wa ubongo katika mchakato wote wa ugonjwa. Kando na upogoaji wa sinepsi, ukiukwaji wa jumla katika njia ya exocytic pia unaweza kusababisha usemi tofauti wa ubongo na CSF wa vialama vya niuroni. Idadi ya tafiti zimeonyesha kuwa maudhui ya exosomes katika pathogenesis ya ubongo AD imebadilika (52). Njia ya ziada ya seli pia inahusika katika kuenea kwa Aβ (53, 54). Ni muhimu kuzingatia kwamba ukandamizaji wa usiri wa exosomal unaweza kupunguza ugonjwa wa AD-kama katika mifano ya panya ya AD transgenic (55).
Wakati huo huo, protini katika jopo la mishipa ilionyesha ongezeko la wastani katika ubongo wa AD, lakini ilipungua kwa kiasi kikubwa katika CSF. Kutofanya kazi kwa kizuizi cha damu-ubongo (BBB) kunaweza kuelezea matokeo haya. Masomo mengi ya kujitegemea ya baada ya kifo yameonyesha kuvunjika kwa BBB katika AD (56, 57). Masomo haya yalithibitisha shughuli mbalimbali zisizo za kawaida zinazozunguka safu hii ya seli za endothelial iliyofungwa vizuri, ikiwa ni pamoja na kuvuja kwa kapilari ya ubongo na mkusanyiko wa perivascular wa protini zinazozalishwa na damu (57). Hii inaweza kutoa maelezo rahisi kwa protini za mishipa iliyoinuliwa kwenye ubongo, lakini haiwezi kueleza kikamilifu upungufu wa protini hizi katika maji ya cerebrospinal. Uwezekano mmoja ni kwamba mfumo mkuu wa neva unatenganisha kikamilifu molekuli hizi ili kutatua tatizo la kuongezeka kwa kuvimba na matatizo ya oxidative. Kupungua kwa baadhi ya protini kali zaidi za CSF katika paneli hii, hasa zile zinazohusika katika udhibiti wa lipoprotein, kunahusiana na kuzuiwa kwa viwango vya madhara vya kuvimba na mchakato wa neuroprotective wa spishi tendaji za oksijeni. Hii ni kweli kwa Paroxonase 1 (PON1), enzyme inayofunga lipoprotein inayohusika na kupunguza viwango vya mkazo wa oksidi kwenye mzunguko (58, 59). Alpha-1-microglobulin/bikunin precursor (AMBP) ni alama nyingine iliyodhibitiwa kwa kiasi kikubwa ya kundi la mishipa. Ni mtangulizi wa bikunin ya lipid transporter, ambayo pia inahusika katika ukandamizaji wa kuvimba na Ulinzi wa neva (60, 61).
Licha ya dhana mbalimbali za kuvutia, kutokuwa na uwezo wa kuchunguza moja kwa moja taratibu za ugonjwa wa biochemical ni kizuizi kinachojulikana cha uchambuzi wa proteomics inayotokana na ugunduzi. Kwa hiyo, utafiti zaidi ni muhimu ili kufafanua kwa ujasiri mifumo nyuma ya paneli hizi za biomarker. Ili kuelekea katika ukuzaji wa uchanganuzi wa kimatibabu unaotegemea MS, mwelekeo wa siku zijazo pia unahitaji utumiaji wa mbinu za kiasi zinazolengwa kwa uthibitishaji wa alama za kibayolojia kwa kiasi kikubwa, kama vile ufuatiliaji wa majibu ya kuchagua au sambamba (62). Hivi majuzi tulitumia ufuatiliaji wa majibu sambamba (63) ili kuthibitisha mabadiliko mengi ya protini ya CSF yaliyofafanuliwa hapa. Malengo kadhaa ya paneli za kipaumbele yamehesabiwa kwa usahihi mkubwa, ikiwa ni pamoja na YWHAZ, ALDOA, na SMOC1, ambayo huweka ramani kwa sinepsi, kimetaboliki, na paneli za kuvimba, mtawalia (63). Upataji Huru wa Data (DIA) na mikakati mingine inayotegemea MS inaweza pia kuwa muhimu kwa uthibitishaji lengwa. Bud na wengine. (64) Hivi majuzi ilidhihirishwa kuwa kuna mwingiliano mkubwa kati ya vialama vya AD vilivyobainishwa katika seti yetu ya data ya ugunduzi wa CSF na seti huru ya data ya DIA-MS, ambayo ina takriban sampuli 200 za CSF kutoka makundi matatu tofauti ya Ulaya . Tafiti hizi za hivi majuzi zinaunga mkono uwezo wa vidirisha vyetu kubadilika kuwa ugunduzi unaotegemewa kulingana na MS. Kingamwili asilia na ugunduzi unaotegemea aptamer pia ni muhimu kwa ukuzaji zaidi wa vialama muhimu vya AD. Kwa sababu ya wingi mdogo wa CSF, ni vigumu zaidi kugundua viashirio hivi kwa kutumia mbinu za juu za MS. NEFL na NRGN ni mifano miwili kama hiyo ya viashirio vya chini vya CSF, ambavyo vimeratibiwa kwenye paneli katika uchanganuzi wetu wa kina, lakini haziwezi kutambuliwa kwa uhakika kwa kutumia mkakati wetu mmoja wa MS. Mikakati ya kulenga kulingana na kingamwili nyingi, kama vile PEA, inaweza kukuza mabadiliko ya kimatibabu ya vialamisho hivi.
Kwa ujumla, utafiti huu unatoa mbinu ya kipekee ya proteomics kwa ajili ya utambuzi na uthibitishaji wa alama za bioalama za CSF AD kulingana na mifumo tofauti. Kuboresha vidirisha vya alama hizi kwenye vikundi vya ziada vya AD na mifumo ya MS kunaweza kuthibitisha kuahidi kuendeleza utabaka na matibabu ya hatari za AD. Uchunguzi unaotathmini kiwango cha longitudinal cha paneli hizi kwa wakati pia ni muhimu ili kubaini ni mchanganyiko gani wa vialamisho unaoweka vyema hatari ya ugonjwa wa mapema na mabadiliko ya ukali wa ugonjwa.
Isipokuwa sampuli 3 zilizonakiliwa na CSF, sampuli zote za CSF zilizotumiwa katika utafiti huu zilikusanywa chini ya ufadhili wa Emory ADRC au taasisi za utafiti zinazohusiana kwa karibu. Jumla ya seti nne za sampuli za Emory CSF zilitumika katika tafiti hizi za proteomics. Kundi la CSF lilipatikana kuwa na sampuli kutoka kwa vidhibiti 20 vya afya na wagonjwa 20 wa AD. Nakala ya 1 ya CSF inajumuisha sampuli kutoka kwa vidhibiti 32 vya afya, watu 31 wa AsymAD, na watu 33 wa AD. Nakala 2 ya CSF ina vidhibiti 147 na sampuli 150 za AD. Kundi 4 la replication 4 la magonjwa mbalimbali la CSF lilijumuisha vidhibiti 18, 17 AD, 19 ALS, 13 PD, na sampuli 11 za FTD. Kulingana na makubaliano yaliyoidhinishwa na Bodi ya Ukaguzi wa Kitaasisi ya Chuo Kikuu cha Emory, washiriki wote wa utafiti wa Emory walipata kibali cha kufahamu. Kulingana na Miongozo Bora ya Kitaifa ya Mazoezi ya Kuzeeka ya 2014 kwa Vituo vya Alzeima (https://alz.washington.edu/BiospecimenTaskForce.html), kiowevu cha ubongo kilikusanywa na kuhifadhiwa kwa kutobolewa kiunoni. Wagonjwa wa Udhibiti na AsymAD na AD walipokea tathmini sanifu ya utambuzi katika Kliniki ya Neurology ya Utambuzi ya Emory au Goizueta ADRC. Sampuli zao za maji ya cerebrospinal zilijaribiwa na INNO-BIA AlzBio3 Luminex kwa ELISA Aβ1-42, jumla ya tau na uchambuzi wa p-tau (65). Thamani za ELISA hutumiwa kusaidia uainishaji wa uchunguzi wa masomo kulingana na vigezo vilivyowekwa vya kukatwa kwa alama ya kibaolojia ya AD (66, 67). Data ya msingi ya demografia na uchunguzi kwa ajili ya uchunguzi mwingine wa CSF (FTD, ALS, na PD) pia hupatikana kutoka kwa Emory ADRC au taasisi tanzu za utafiti. Metadata ya kesi za muhtasari wa kesi hizi za Emory CSF inaweza kupatikana katika Jedwali S1A. Sifa za kikundi cha 3 cha uigaji cha CSF cha Uswizi zimechapishwa hapo awali (45).
CSF imepata sampuli. Ili kuongeza kina cha ugunduzi wetu wa seti ya data ya CSF, matumizi ya kinga ya protini za wingi yalifanywa kabla ya trypsinization. Kwa kifupi, 130 μl ya CSF kutoka kwa sampuli 40 za CSF na ujazo sawa (130 μl) wa Resin ya Kupungua kwa Protini ya Juu14 (Thermo Fisher Scientific, A36372) iliwekwa kwenye safu wima (Thermo Fisher Scientific, A89868) kwenye chumba. Incubate joto). Baada ya kusokota kwa dakika 15, weka katikati sampuli kwa 1000g kwa dakika 2. Kifaa cha kichujio cha 3K ultracentrifugal (Millipore, UFC500396) kilitumika kukazia sampuli ya maji machafu kwa kuweka katikati katika 14,000g kwa dakika 30. Punguza ujazo wote wa sampuli hadi 75 μl na saline iliyotiwa phosphate. Mkusanyiko wa protini ulitathminiwa kwa mbinu ya asidi bicinchoniniki (BCA) kulingana na itifaki ya mtengenezaji (Thermo Fisher Scientific). CSF isiyo na kinga (60 μl) kutoka kwa sampuli zote 40 iliyeyushwa na lysyl endopeptidase (LysC) na trypsin. Kwa kifupi, sampuli ilipunguzwa na alkylated na 1.2 μl 0.5 M tris-2 (-carboxyethyl) -phosphine na 3 μl 0.8 M chloroacetamide katika 90 ° C kwa dakika 10, na kisha sonicated katika umwagaji wa maji kwa dakika 15. Sampuli ilipunguzwa kwa 193 μl 8 M bafa ya urea [8 M urea na 100 mm NaHPO4 (pH 8.5)] hadi mkusanyiko wa mwisho wa urea 6 M. LysC (4.5 μg; Wako) hutumiwa kwa usagaji chakula usiku kucha kwenye joto la kawaida. Sampuli ilipunguzwa hadi 1 M urea na 50 mm ammonium bicarbonate (ABC) (68). Ongeza kiasi sawa (4.5 μg) cha trypsin (Promega), kisha uachilie sampuli hiyo kwa saa 12. Tia asidi ya peptidi iliyomeng'enywa hadi mkusanyiko wa mwisho wa 1% fomic acid (FA) na 0.1% trifluoroacetic acid (TFA) (66), na kisha uiunde kwa safuwima ya 50 mg Sep-Pak C18 (Waters) kama ilivyoelezwa hapo juu (25) . Kisha peptidi ilitolewa katika 1 ml ya 50% asetonitrile (ACN). Ili kusawazisha upimaji wa protini kwenye bati (25), aliquots 100 μl kutoka sampuli zote 40 za CSF ziliunganishwa ili kutoa sampuli mchanganyiko, ambayo iligawanywa katika sampuli tano za viwango vya ndani vya kimataifa (GIS) (48). Sampuli zote za kibinafsi na viwango vya pamoja hukaushwa na utupu wa kasi ya juu (Labconco).
CSF inakili sampuli. Dayon na wenzake hapo awali wameelezea upungufu wa kinga na usagaji wa sampuli 3 za CSF (45, 46). Sampuli zilizobaki za kuiga hazikuwa na kinga ya mtu binafsi. Chemsha sampuli hizi ambazo hazijaondolewa kwenye trypsin kama ilivyoelezewa hapo awali (17). Kwa kila uchanganuzi unaorudiwa, aliquots 120 μl za peptidi iliyoondolewa kutoka kwa kila sampuli ziliunganishwa pamoja na kugawanywa katika aliquots za ujazo sawa ili kutumika kama kiwango cha ndani cha kimataifa kilicho na lebo ya TMT (48). Sampuli zote za kibinafsi na viwango vya pamoja hukaushwa na utupu wa kasi ya juu (Labconco). Ili kuongeza ishara ya protini ya CSF ya kiwango cha chini, kwa kuchanganya 125 μl kutoka kwa kila sampuli, sampuli "iliyoimarishwa" ilitayarishwa kwa kila uchanganuzi wa nakala [yaani, sampuli ya kibayolojia inayoiga sampuli ya utafiti, lakini kiasi kinachopatikana ni. kubwa zaidi (37, 69)] iliunganishwa katika sampuli mchanganyiko ya CSF (17). Sampuli iliyochanganyika basi iliondolewa kwa kinga kwa kutumia 12 ml ya High Select Top14 Wingi Protein Removal Resin (Thermo Fisher Scientific, A36372), iliyeyushwa kama ilivyoelezwa hapo juu, na kujumuishwa katika uwekaji lebo nyingi za TMT zilizofuata.
Muda wa kutuma: Aug-27-2021